Anfang des 21. Jahrhunderts ist die Umbrella Corporation das größte Industrieunternehmen der Vereinigten Staaten. Der mächtige Konzern hat großen finanziellen und politischen Einfluss in der Gesellschaft und gilt in der Öffentlichkeit als führender Anbieter von Computertechnik, Biotechnologie und Arzneimitteln. Unbemerkt von der Öffentlichkeit erzielt das Unternehmen jedoch seine enormen Gewinne in den Bereichen Rüstungstechnologie, biologische Waffen und Genmanipulation.
In einem geheimen Forschungslabor, genannt Hive (englisch wörtlich: Bienenstock), arbeiten rund 500 Mitarbeiter abgeschottet unter der Erde. Dort entwickelten sie das sogenannte T-Virus, welches in der Lage ist, tote Zellen wiederzubeleben. Ein Unbekannter stiehlt Proben vom T-Virus und von dessen Gegenmittel. Um anschließend alle Spuren zu verwischen, setzt er das Virus im Labor frei. Dieses gelangt über das Belüftungssystem in den gesamten Laborkomplex. Der mit künstlicher Intelligenz ausgestattete Zentralcomputer, genannt Red Queen, bemerkt diesen Zwischenfall wenig später, verschließt daraufhin alle Türen und tötet alle Menschen innerhalb des Komplexes durch Flutung der Räume mit einströmendem Halon-Gas, um zu verhindern, dass Menschen und somit das T-Virus aus dem Komplex entweichen können.
In einer Villa in der Nähe der Stadt Raccoon City erwacht eine junge Frau – Alice – aus einer Bewusstlosigkeit und kann sich vorerst an nichts mehr erinnern. Ein Mann – Matt Addison – taucht auf, kurz darauf stürmt ein bewaffnetes Team die Villa und nimmt beide durch einen versteckten Zugang zu einem unterirdischen Zug mit. Dort finden sie den ebenfalls bewusstlosen Spence, der anscheinend der Ehemann von Alice ist. Als auch dieser zu sich kommt, erfahren sie, dass die Villa der getarnte Noteingang zum Hive ist, Alice und Spence als Sicherheitskräfte der Umbrella Corporation den Eingang beschützen sollten und ihre Ehe lediglich Tarnung ist. Ihr Gedächtnisverlust ist die Auswirkung eines Nervengases, welches durch Aktivierung des Sicherheitssystems der Red Queen versprüht wurde. Der Zug unterhalb der Villa führt zum Hive, der direkt unterhalb der Stadt Raccoon City liegt. Das Team hat die Aufgabe, den anscheinend außer Kontrolle geratenen Zentralcomputer Red Queen abzuschalten.
Es gelingt ihnen, den Zentralcomputer durch einen elektromagnetischen Impuls abzuschalten, zuvor werden jedoch vier Personen durch dessen Abwehrmechanismus getötet. Durch das Abschalten wurden allerdings auch alle Türen entriegelt, womit die getöteten Mitarbeiter, welche inzwischen zu Zombies mutiert sind, freigelassen wurden. Diese jagen nun die lebenden Menschen, um sie zu fressen. Zusätzlich drängt die Zeit, da sich die Zugangsschleuse der Villa zum Hive in rund einer Stunde automatisch verriegeln wird und sich danach nicht mehr öffnen lässt.
Um einen Fluchtweg an die Oberfläche zu finden, müssen sie die Red Queen befragen und deshalb wieder aktivieren. Unter Androhung der endgültigen Abschaltung gelingt es ihnen, Informationen über einen Fluchtweg durch Versorgungsschächte zu erhalten. Nachdem sie wieder im Labor angekommen sind, erlangt Alice langsam ihr Gedächtnis zurück, und sie erinnert sich, dass es ein Gegenmittel zum T-Virus gibt und wo es gelagert wurde. Das Gegenmittel ist jedoch nicht mehr da. Wie sich bald herausstellt, ist Spence dafür verantwortlich: Er ist der Unbekannte, der auch das T-Virus stehlen wollte.
Matt und dessen im Hive arbeitende Schwester Lisa Addison hatten versucht, die Öffentlichkeit über die illegalen Arbeiten im Hive aufzuklären. Dafür sollte Lisa eine Probe des T-Virus herausschmuggeln, wobei sie von Alice unterstützt wurde, die sie mit geheimen Zugangscodes versorgte. Spence hatte jedoch Lisa und Alice belauscht und wusste so von deren Plan. Er kam ihnen zuvor, indem er Virus und Gegenmittel raubte, um sie zu Geld zu machen, und zur Vertuschung seiner Tat eine Probe des Virus im Labor freisetzte. Da er nicht wusste, dass sich das Sicherheitssystem der Red Queen auch auf den Bereich außerhalb des Hive erstreckte, wurde er jedoch ebenfalls durch das Nervengas bewusstlos, ehe er verschwinden konnte.
Das T-Virus und das Gegenmittel hat er an Bord des Zuges versteckt, der auch das Team in den Hive brachte. Da Spence nun aufgeflogen ist, flüchtet er zurück zum Zug, wird dort aber von einem Wesen getötet, das Licker genannt wird und von den Umbrella-Forschern durch direkte Injektion des T-Virus in lebendes Gewebe geschaffen wurde. Im Gegensatz zu den Untoten, die lediglich ihrem Grundtrieb zu fressen nachgehen, verfügt der Licker über Intelligenz und kann sich zudem weiterentwickeln, nachdem er fremde DNA aufgenommen hat.
Alice und den anderen gelingt es, das T-Virus und das Gegenmittel sicherzustellen und den Zug zu besteigen, doch durch einen Angriff des Lickers werden alle bis auf Alice und Matt getötet. Rain, die Stunden vorher durch mehrere Zombies mit dem Virus infiziert wurde, kehrt nun selbst – trotz injiziertem Gegenmittel – als Untote zurück und wird von Matt erschossen. Als sie in die Villa zurückkehren, beginnt Matt aufgrund einer Verwundung, die ihm der Licker zugefügt hat, zu mutieren. Bevor Alice ihm das Gegenmittel spritzen kann, werden sie von Umbrella-Forschern getrennt und unter Quarantäne gestellt. Matt beginnt sich zu verwandeln und einer der Forscher erklärt, dass man ihn für das „Nemesis-Programm“ benötigt und die Arbeit im Hive wieder aufnehmen werde.
Einige Zeit später wacht Alice plötzlich im Krankenhaus von Raccoon City auf. Sie ist allein in einem großen Raum und mit Kabeln an medizinische Apparaturen angeschlossen. Sie reißt die Kabel ab, verlässt die menschenleere Klinik und steht in der letzten Einstellung in der völlig verwüsteten Stadt. Das T-Virus ist offenbar an die Oberfläche gelangt und hat sich ausgebreitet. Alice bereitet sich auf den Kampf ums Überleben vor.
Es ist der erste Teil der Resident-Evil-Realfilmreihe, die lose auf der gleichnamigen Videospielreihe basiert und fünf Fortsetzungen hervorbrachte: Resident Evil: Apocalypse (2004), Resident Evil: Extinction (2007), Resident Evil: Afterlife (2010), Resident Evil: Retribution (2012) und Resident Evil: The Final Chapter (2016).
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